寡核苷酸的HPLC分析方法
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治療性寡核苷酸是由固相化學合成工藝生產(chǎn)。在合成過程中會產(chǎn)生工藝相關雜質和產(chǎn)品相關雜質。產(chǎn)品相關雜質包含許多目標產(chǎn)物的類似物（分子量的差別：堿基數(shù)N-1、N、N+1等），磷酸基S化等的不對稱化合物、異構體等。因此，雜質的分析監(jiān)控對工藝和質量控制就顯得十分重要。液相色譜技術具有樣品適用范圍廣、分離效率高、速度快等特點，已成為核酸藥物生產(chǎn)與質控分析必不可少的重要手段。
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圖1?寡核苷酸的磷酸化及糖基修飾
磷酸化修飾：空間配置引起的異構體（但都是有效成分）
糖基修飾：通過架橋增強對核酸酶的耐受和降低毒性（如嗎琳環(huán)型）
堿基修飾：適配體立體構造的多樣性
表1 寡核苷酸分離常用的HPLC分離模式及適用的TSKgel色譜
分離模式 | 分離原理 | 特長及用途 | 適用的色譜柱 |
尺寸排阻色譜（SEC） | 分析物的分子尺寸大小 | 1.可以使用接近生理條件的洗脫溶液進行分離 2.基于堿基數(shù)不同分離（Mw） 3.用于質量控制或純度含量分析 ? | TSKgel UP-SW系列 |
TSKgel SWXL系列 | |||
TSKgel PWXL系列 | |||
TSKgel G-DNA-PW系列 | |||
離子交換色譜（IEC） | 分析物與固定相間的離子相互作用 | 樣品載量高 | TSKgel DNA-NPR ? |
可以根據(jù)磷酸基的數(shù)量分離樣品（N-1, N, N+1 ） ? | TSKgel DNA-STAT | ||
反相色譜（RPC） | 分析物與填料間疏水性 相互作用 | 分辨率高 結構異構體、不對稱體的分離 | TSKgel Oligo?DNA-RP |
TSKgel ODS-100V | |||
TSKgel Super-ODS | |||
親水作用色譜（HILIC） | 分析物與填料間親水性 相互作用 | 增強HILIC-ESI-MS質譜檢測靈敏度 （不加離子對試劑條件下） 結構異構體、不對稱體的分離 ? | TSKgel Amide-80 2μm |
應用實例
質粒的HPLC分析方法
隨著基因治療和DNA疫苗的迅速發(fā)展，高純度的質粒DNA的需求量越來越大。藥物級質粒DNA必須要符合宿主相關雜質、均一性方面的要求。因此，在質粒純度檢測時，需要區(qū)分出超螺旋、開環(huán)和線型三種拓撲異構體質粒。
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表2?質粒分離常用的HPLC分離模式及適用的TSKgel色譜柱
分離模式 | 分離原理 | 特長及用途 | 適用的色譜柱 |
尺寸排阻色譜（SEC） | 分子尺寸大小 （質粒分子較大，在排阻V0附近洗脫） | 用于質量控制或純度含量分析 | TSKgel G6000PWxl TSKgel G-DNA-PW |
離子交換色譜（IEC） | 電荷的差異 （質粒帶高負電荷） | 分離質粒拓撲異構體 | TSKgel DNA-NPR |
疏水色譜（HIC） | 疏水性的差異 | 分離質粒拓撲異構體 | TSKgel Butyl-NPR |
應用實例
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